ImageJ är en gratisprogramvara som är utvecklad av en stor mängd programmerare och akademiska institutioner. Ladda ner FIJI genom att klicka här. Med ImageJ (versionen som vi använder heter FIJI) kan du kalibrera, mäta och behandla bilder och data från nästan vilken slags mikroskop som helst. När man använder ImageJ i ett vetenskapligt arbete kan man (och bör) referera som utvecklat det. Läs mer om hur man refererar till ImageJ här.

Kalibrera bilden och lägg in skalstreck

Starta FIJI och välj ”Open…”

Öppna filen: ”10x - Nikon CFI - Plan Ph1 - NA025.jpg”. Detta är en bild på ett 1 mm skalstreck med 10 mikrometersindelningar tagna med 10x Nikon objektivet.

Börja med att välja förstoringsglaset och zooma in på den nedre delen av skalstrecket. Om du har markerat förstoringsglaset kan du hålla nere ALT + klick för att zooma ut. Om du bara klickar zoomar du in.

Efter det väljer du ”strecket” som är ett linjemarkeringsverktyg och markerar ett antal stora markeringar. I bilden har jag markerat 4 stora indelningar = 40 små indelningar = 400 mikrometer.

Zooma in på nedre delen av skalstrecket. De vita prickarna är luftbubblor i glaset. Varje stor indelning är 100 mikrometer.

Markera ett jämnt antal indelningar, här 4 st. Efter det väljer du ”Analyze -> Set scale…”

I ”Known distance” skriver du skalans längd (här 400) och enheten sätter du till ”micron”. Skriv ner förstoringen på ett papper, här ca 1.72 pixels/micron. Om du klickar i ”Global” kommer förstoringen att sparas och föras över till alla bilder som du öppnar efter den här. Klicka ”OK”.

Öppna sedan en andra bild tagen med detta objektiv (Nikon 10x). Notera att du behöver olika kalibreringar för 4x, 10x och 50x objektiven. Här har jag öppnat bilden ”Fjärilsöga – 10x.jpg”.

Du kan sedan kontrollera att bilden har samma förstoring genom att klicka på ”Set scale…”. Om ”Global” var vald i föregående meny, så bör det vara 1.72 pixels/micron.

Du kan t.ex. beskära direkt i FIJI genom att välja den rektangulära markeringen och sedan välja ”Image->Crop…”.

Nu när bilden är kalibrerad, och i det här fallet beskuren (inget måste) så kan du lägga till ett snyggt skalstreck. Det gör du genom att välja ”Analyze->Tools->Add scale bar…”.

Välj ett jämnt och snyggt antal mikrometer, t.ex. 100, 200, 500. Justera ”height in pixels, font size” så att storleken blir bra. Jag rekommenderar att sätta skalstrecket i ”lower right” och att använda vit text på svart bakgrund.

Grattis! Nu har du gjort ett snyggare skalstreck än 80% av alla publicerade bilder. Bilden kan nu sparas. OBS: Spara en kopia av den redigerade bilden och skriv inte över originalet. Fördelen med att beskära i ImageJ är att det är lätt att skapa flera bilder i olika förstoringar och behålla korrekt förstoring.

Mätningar från bild i ImageJ

Nu ska vi mäta några detaljer i bilderna och skapa ett histogram (fördelningsplot) över mätvärdena. Börja med att gå in på ”Analyze->Set measurements”. Klicka i ”Add overlay”. Det kommer bränna in de uppmätta längderna i bilden.

Du kan också klicka ur ”Area”, ”Min & max gray value” och ”Mean grey value”. Vi kommer inte vara intresserade av dessa. Klicka sen OK.

Zooma in i bilden så att du kan se tydligt det ska mäta. Rita ett streck med linjeverktyget och tryck sedan Ctrl + M. Alternativt välj ”Analyze->Measure”. Det uppmätta strecket kommer sedan att brännas in med ett index och sedan läggas till i en lista i ett fönster som heter ”Results”.

Försök vara så noggrann som du kan och mäta upp de detaljer som du är intresserad av på ett konsekvent sätt. För att få bra statistik över t.ex. en storleksfördelning krävs ofta minst 100 mätvärden, gärna fler. En bra övning är också att prova att uppskatta mätfelet.

Resultatlistan ”Results” kan sedan exporteras och behandlas i exempelvis MS Excel. Du kan också få en direkt överblick över medelvärde och standardavvikelse genom att använda ”Analyze->Summarize”. Resultaten visas på de 4 sista raderna i resultatlistan. Mean = medelvärde, SD = standardavvikelse.

Det fungerar precis på samma sätt att göra motsvarande mätning i en SEM-bild. Skillnaden är att skalstrecket redan finns inbränt längst ner i bilden. Här har jag öppnat filen: ”Fotoniska fjäll- grön fjäril.tif”.

Eftersom den här bilden har en annan förstoring, så kan du att behöva trycka på ”Disable global calibration” när den öppnas.

Zooma in på skalstrecket och lägg en gul linjemarkering över hela skalstreckets längd. Sedan kan du på samma sätt ange längdskalan (”Analyze –> Set scale…”) som här är 5 mikrometer. (Frågetecknet ”?” betyder mikrometer). Klicka sedan på OK.

Det här är ett annat sätt att mäta avstånd. Här har vi först beskurit ovanstående bild. Sedan har vi lagt in ett snyggt skalstreck.

Efter det har jag lagt på en lång linjemarkering vinkelrätt mot den periodiska strukturen. Genom att sedan välja ”Analyze->Plot profile” kan jag sedan få en plot av gråskaleintensiteten mot längden, vilket gör det lätt att mäta perioden i vingens fjäll. Det går sedan utmärkt att mäta avstånd direkt i linjeplotten, precis som i bilden.

Tänk på att precisionen och den statistiska nogrannheten ökar då ni mäter över många ”fjällkanter”. I bilden är det 15 kanter över 10 mikrometer, vilket ger perioden 10/15 = 0.67 mikrometer = 670 nanometer.